分离方案设计:通过转基因工程用大肠杆菌表达人胰岛素，发酵结束后, 获得有活性纯的胰岛素，需要经过哪些分离步骤

从大肠杆菌中分离获得活性和纯度高的人胰岛素通常涉及到多个步骤， 主要是结合细菌的特性及胰岛素蛋白质的物理化学特性进行设计。以下是一个可能的分离方案流程：

1. 发酵后处理

• 细胞收集：移除培养基中的大肠杆菌细胞，可使用离心机或过滤系统。

2. 细胞破碎

• 机械破碎：通过超声波、高压均质器等方式破坏菌体细胞壁，释放目标蛋白（即胰岛素）。
• 酶解法：使用特定的酶来降解细菌细胞壁。

3. 粗提

从破裂后的粗混合物中提取目标蛋白。

4. 初步纯化

• 沉淀：利用硫酸铵等盐类进行盐析沉淀，可以添加氯化钠或硫酸锰帮助澄清。
• 凝胶过滤色谱：大小排阻色谱（SEC）用于去除较大分子量杂质。
• 阴阳离子交换色谱：根据要提取胰岛素的电荷性质选择合适的色谱树脂。

5. 高效纯化

• 反向液相色谱(RPLC)：通过特定的有机溶剂组合提高分离效果。
• 亲和色谱：可以用抗人胰岛素抗体消毒发生亲和作用的柱体。
• 高效液相色谱（HPLC）：对目标蛋白进行精细的纯化。

6. 脱盐与透析

• 使用透析管或者脱盐柱来去除借用的缓冲液和任何小分子污染物如盐和其他添加剂残留物。

7. 活性检验与定量

• 生物活性评估：使用胰岛素标准活性测试方法验证最终产品的生物活性。
• 蛋白质浓度测定：利用比色法或者UV-Vis光谱等方法确定蛋白质的浓度。

8. 成品包装

• 将纯化的胰岛素灌入无菌容器中进行保存和分发前的质量检验。

9. 质量控制

• 进行完整的质量检测包括蛋白质质量分析、纯度分析、活力测试等。

在整个过程中，需要考虑不同质量标准的胰岛素采集能力以及保留其生物学特性的重要性。每个分离步骤都需要仔细考虑以保证目标蛋白质不会在处理过程中降解或失活。此外，也必须定期对所用设备和操作条件进行消毒和验证，以确保产品无污染